獸用化學(xué)藥品注射劑滅菌和無菌工藝研究及驗證

指導(dǎo)原則　

一、概述

注射劑系指原料藥物與適宜的輔料制成的供注入體內(nèi)的無菌制劑。從嚴(yán)格意義上講，無菌制劑應(yīng)不含任何活的微生物，但由于目前檢驗手段的局限性，絕對無菌的概念不能適用于對整批產(chǎn)品的無菌性評價，因此目前所使用的“無菌”概念，是概率意義上的“無菌”。特定批次獸藥的無菌特性只能通過該批獸藥中活微生物存在的概率低至某個可接受的水平，即無菌保證水平（Sterility Assurance Level，SAL）來表征^[1]，而這種概率意義上的無菌需通過合理設(shè)計和全面驗證的滅菌/除菌工藝過程、良好的無菌保證體系以及在生產(chǎn)過程中嚴(yán)格執(zhí)行獸藥生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）^[2,3]予以保證。

本指導(dǎo)原則主要參考國內(nèi)外相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則和標(biāo)準(zhǔn)^[4-10]起草制訂，重點對注射劑常用的滅菌/無菌工藝，即濕熱滅菌為主的最終滅菌工藝（Terminal Sterilization Process）和無菌生產(chǎn)工藝（Aseptic Process）的研究和驗證進(jìn)行闡述，旨在促進(jìn)現(xiàn)階段獸用化學(xué)藥品注射劑的研究和評價工作的開展。本指導(dǎo)原則主要適用于注射劑注冊申報過程中對滅菌/無菌工藝進(jìn)行的研究和驗證工作，相關(guān)儀器設(shè)備等的確認(rèn)/驗證及常規(guī)再驗證不包括在本指導(dǎo)原則的范圍內(nèi)。

　　本指導(dǎo)原則的起草是基于對該問題的當(dāng)前認(rèn)知，隨著相關(guān)法規(guī)的不斷完善以及藥物研究技術(shù)要求的提高，本指導(dǎo)原則將不斷修訂并完善。

二、注射劑濕熱滅菌工藝

　　（一）濕熱滅菌工藝的研究

　　1. 濕熱滅菌工藝的確定依據(jù)

　　滅菌工藝的選擇一般按照滅菌工藝選擇的決策樹（詳見附件1）進(jìn)行，濕熱滅菌工藝是決策樹中首先考慮的滅菌方法。濕熱滅菌法系指將物品置于滅菌設(shè)備內(nèi)利用飽和蒸汽、蒸汽-空氣混合物、蒸汽-空氣-水混合物、過熱水等手段使微生物菌體中的蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生變性而殺滅微生物的方法。

　　注射劑的濕熱滅菌工藝應(yīng)首選過度殺滅法，即F₀（標(biāo)準(zhǔn)滅菌時間）值大于等于12分鐘的滅菌工藝；對熱不穩(wěn)定的藥物，可以選擇殘存概率法，即F₀值大于等于8分鐘的滅菌工藝。如果F₀值不能達(dá)到8分鐘，提示選擇濕熱滅菌工藝不合適，需要考慮無菌生產(chǎn)工藝。

　　以上兩種濕熱滅菌工藝都可以在實際生產(chǎn)中使用，具體選擇哪種滅菌工藝，在很大程度上取決于產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性。藥物是否能耐受濕熱滅菌工藝，除了與藥物活性成分的化學(xué)性質(zhì)相關(guān)外，還與制劑的處方、工藝、包裝容器等密切相關(guān)，所以在初期的工藝設(shè)計過程中需要通過對藥物熱穩(wěn)定性的綜合分析來確定濕熱滅菌工藝的可行性。

　　一般而言，需要通過各個方面的研究，使藥物盡可能地可以采用濕熱滅菌工藝。只有在理論和實踐均證明即使采用了各種可行的技術(shù)方法之后，藥物活性成分依然無法耐受濕熱滅菌工藝時，才能選擇無菌生產(chǎn)工藝。任何商業(yè)上的考慮均不能作為不采用具有最高無菌保證水平的最終滅菌工藝的理由。

　　1.1 藥物活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點與穩(wěn)定性

　　通過對藥物活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，可以初步判斷藥物活性成分的穩(wěn)定性，如果其結(jié)構(gòu)中含有一些對熱不穩(wěn)定的化學(xué)基團(tuán)，則提示該藥物活性成分的熱穩(wěn)定性可能較差。在此基礎(chǔ)之上，還應(yīng)該通過設(shè)計一系列的強制降解試驗對藥物活性成分的穩(wěn)定性做進(jìn)一步研究確認(rèn)，了解在各種條件下可能發(fā)生的降解反應(yīng)，以便在處方工藝研究中采取針對性的措施，保障產(chǎn)品能夠采用濕熱滅菌工藝。對于一般降解雜質(zhì)，不應(yīng)僅僅因為其含量超過獸藥雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則^[1]規(guī)定的限度，就排除濕熱滅菌工藝而不進(jìn)行論證，如果一般降解雜質(zhì)確證為代謝產(chǎn)物或其含量水平已經(jīng)過安全性研究確認(rèn)在可接受的范圍內(nèi)，仍推薦采用濕熱滅菌工藝。

　　1.2 處方工藝

　　在對藥物活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點與穩(wěn)定性進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上，可以有針對性地進(jìn)行處方工藝的優(yōu)化研究。例如采用充氮工藝或在處方中加入適宜的抗氧化劑來減少氧化雜質(zhì)的產(chǎn)生；選擇利于藥物活性成分穩(wěn)定的pH值范圍、溶劑系統(tǒng)、輔料等；通過滅菌時間和滅菌溫度的調(diào)整來篩選藥物活性成分可以耐受的濕熱滅菌工藝條件等。

　　1.3 包裝系統(tǒng)

　　注射劑包裝系統(tǒng)的選擇和設(shè)計也是可能影響濕熱滅菌工藝條件選擇和最終無菌保證水平的重要因素。研究中需要結(jié)合產(chǎn)品特性、包裝系統(tǒng)的相容性、以及滅菌器的滅菌原理等，對包裝系統(tǒng)的種類、性狀、尺寸進(jìn)行篩選，保證所選的滅菌工藝條件不會對包裝系統(tǒng)的密封性和相容性產(chǎn)生不利的影響，如包裝系統(tǒng)的變形、破裂，或者浸出物超過可接受的水平等。應(yīng)該注意的是，使用熱不穩(wěn)定的包裝系統(tǒng)不能作為選擇無菌工藝的理由。

　　1.4 注射劑的穩(wěn)定性研究

　　無論使用何種設(shè)計方法，都需要進(jìn)行最終滅菌產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究?？疾熳罱K滅菌工藝對產(chǎn)品穩(wěn)定性影響的指標(biāo)可包括有關(guān)物質(zhì)、含量、pH值、顏色以及產(chǎn)品的其它關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

　　滅菌時，微生物的殺滅效果和藥物活性成分的降解程度都是溫度和時間累積作用的結(jié)果。這意味著加熱和冷卻過程的變化也可能影響微生物的殺滅效果和產(chǎn)品的穩(wěn)定性。因此，穩(wěn)定性研究用樣品最好選取處于最苛刻滅菌條件下的產(chǎn)品，如可選取在熱穿透試驗中F₀最大或滅菌參數(shù)值（最高允許滅菌溫度和/或最長滅菌時間）最大位置處的滅菌產(chǎn)品進(jìn)行穩(wěn)定性考察，以確保產(chǎn)品的質(zhì)量在有效期內(nèi)仍能符合要求。

　　1.5 仿制注射劑滅菌工藝的選擇

　　仿制注射劑選擇的滅菌/除菌工藝，應(yīng)能保證其無菌保證水平不低于原研制劑。如果原研制劑采用了無菌生產(chǎn)工藝，若仿制注射劑對其處方組成合理性、滅菌工藝產(chǎn)生的降解雜質(zhì)等風(fēng)險因素進(jìn)行了全面的論證之后，也應(yīng)按照滅菌工藝選擇的決策樹進(jìn)行滅菌工藝的選擇。

　　2. 微生物污染的監(jiān)控

　　濕熱滅菌工藝的滅菌溫度和時間通常會對微生物，尤其耐受性較大的微生物的殺滅效果產(chǎn)生影響。過度殺滅法假設(shè)的微生物負(fù)荷和耐受性都高于實際情況，理論上能完全殺滅微生物，足以滿足無菌保證水平的要求，因而無需對每一批次產(chǎn)品進(jìn)行滅菌前微生物污染水平的監(jiān)控，從控制熱原的角度，建議按照獸藥GMP管理，以適當(dāng)?shù)念l次對微生物污染水平進(jìn)行監(jiān)測。

　　與過度殺滅法相比，殘存概率法的熱能較低，為不降低產(chǎn)品的無菌保證水平，除了需要對滅菌過程本身進(jìn)行嚴(yán)格的控制以外，還需要通過合理的工藝設(shè)計來降低微生物污染，并采用適當(dāng)?shù)姆椒▽ξ⑸镂廴舅胶湍褪苄赃M(jìn)行監(jiān)測。

　　2.1 降低滅菌前微生物污染的工藝設(shè)計

　　在生產(chǎn)工藝各環(huán)節(jié)引入微生物的風(fēng)險評估基礎(chǔ)上，通?？紤]采用藥液過濾、藥液存放時限控制等方法來降低注射劑滅菌前的微生物污染。雖然藥液過濾在最終滅菌產(chǎn)品的生產(chǎn)中僅僅作為輔助的控制手段，但是在工藝研究過程中，也應(yīng)該對濾膜的孔徑、材質(zhì)、使用周期等基本性質(zhì)進(jìn)行必要的篩選和驗證，并在工藝操作中進(jìn)行相應(yīng)的規(guī)定。藥液在制備、分裝過程中易引起微生物繁殖，尤其一些營養(yǎng)型的注射劑，因此應(yīng)通過必要的考察和驗證來確定藥液配制至過濾前、以及過濾、灌裝后至滅菌前能夠放置的最長時限，并相應(yīng)確定產(chǎn)品的批量和生產(chǎn)周期。

　　2.2 滅菌前微生物污染的監(jiān)測

　　滅菌前微生物污染水平監(jiān)測的取樣應(yīng)覆蓋正常生產(chǎn)的整個過程，應(yīng)基于風(fēng)險評估選取最有代表性的樣品，且要充分考慮到產(chǎn)品從灌裝到滅菌前的放置時間。如果灌裝需要持續(xù)一段時間，通常從每批產(chǎn)品灌裝開始、中間及結(jié)束時分別取樣，也可根據(jù)風(fēng)險評估結(jié)果選取合適的取樣點進(jìn)行取樣。滅菌前微生物污染水平的監(jiān)測方法應(yīng)經(jīng)過驗證，具體操作可參照《中國獸藥典》（2020年版）一部附錄1105“微生物計數(shù)法”和1106“控制菌檢查法”^[1]。

　　對于殘存概率法滅菌前微生物污染水平監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)有污染菌的產(chǎn)品，應(yīng)采用合適的方法進(jìn)行污染菌的耐受性檢查。一般來說，生物指示劑的耐受性用D_T值（耐熱參數(shù)）來表示。耐受性檢查中任何幸存下來或生長的微生物都可以被假定為耐熱菌，一般采用定時煮沸法將其與已知的生物指示劑的耐受性加以比較，必要時，可進(jìn)一步測試耐熱污染菌的D_T 值，D_T值的測定可以參考《中國藥典》（2020年版）四部通則 9208“生物指示劑耐受性檢查法指導(dǎo)原則” ^[11]進(jìn)行，然后根據(jù)滅菌的F₀值、污染菌的數(shù)量與耐受性對產(chǎn)品的無菌性做出評價。當(dāng)產(chǎn)品微生物污染水平超過限度時，應(yīng)對污染菌進(jìn)行鑒別，調(diào)查污染菌的來源并采用相應(yīng)的糾正措施。

　　（二）濕熱滅菌工藝的驗證

　　濕熱滅菌工藝的驗證一般分為物理確認(rèn)和生物學(xué)確認(rèn)兩部分，物理確認(rèn)包括熱分布試驗、熱穿透試驗等，生物學(xué)確認(rèn)主要是微生物挑戰(zhàn)試驗。物理確認(rèn)和生物學(xué)確認(rèn)結(jié)果應(yīng)一致，兩者不能相互替代。

　　1. 物理確認(rèn)

　　1.1 物理確認(rèn)的前提

　　物理確認(rèn)所用的溫度測試系統(tǒng)應(yīng)在驗證和/或試驗前、后進(jìn)行校準(zhǔn)，校準(zhǔn)的頻次應(yīng)根據(jù)儀器設(shè)備的性能、驗證持續(xù)的時間長短來確定。物理確認(rèn)所涉及的滅菌設(shè)備，應(yīng)該在滅菌工藝驗證前已通過設(shè)備確認(rèn)。

　　1.2 空載熱分布試驗

　　如果在實施滅菌工藝驗證前已經(jīng)在包含擬驗證工藝條件下完成了空載熱分布試驗，且在驗證合格期限內(nèi)，原則上可以引用相關(guān)數(shù)據(jù)和結(jié)論。

　　1.3 裝載熱分布試驗

　　裝載熱分布試驗的目的是在擬采用的裝載方式下，考察產(chǎn)品裝載區(qū)內(nèi)實際獲得的滅菌條件與設(shè)計的滅菌周期工藝參數(shù)的符合性。了解裝載區(qū)內(nèi)的溫度分布狀況，包括高溫點（熱點）、低溫點（冷點）的位置，為后續(xù)的評估和驗證提供科學(xué)依據(jù)。裝載熱分布一般在空載熱分布的基礎(chǔ)上進(jìn)行。溫度探頭的個數(shù)和安裝位置應(yīng)綜合滅菌器的幾何形狀、空腔尺寸、產(chǎn)品排列方式以及空載熱分布確認(rèn)的結(jié)果等要素確定，且至少應(yīng)涵蓋空載熱分布測試獲得的高溫點、低溫點，滅菌器自身溫度測試探頭部位等特殊位置。溫度探頭在該階段測試中應(yīng)固定，且安放在待滅菌容器的周圍，注意不能接觸待滅菌容器或非常接近滅菌器內(nèi)壁。

　　裝載熱分布試驗需要考慮最大、最小和生產(chǎn)過程中典型裝載量情況，試驗時應(yīng)盡可能使用待滅菌產(chǎn)品。如果采用類似物，應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品的熱力學(xué)性質(zhì)等進(jìn)行適當(dāng)?shù)娘L(fēng)險評估。待滅菌產(chǎn)品的裝載方式和滅菌工藝等各項參數(shù)的設(shè)定應(yīng)與正常生產(chǎn)時一致，應(yīng)采用適宜的方式（圖表或照片）描述產(chǎn)品的裝載方式，并評估探頭放置是否合理。每一裝載方式的熱分布試驗需要至少連續(xù)進(jìn)行三次。

　　1.4 熱穿透試驗

　　熱穿透試驗用于考察滅菌器和滅菌程序?qū)Υ郎缇a(chǎn)品的適用性，目的是確認(rèn)產(chǎn)品內(nèi)部也能達(dá)到預(yù)定的滅菌溫度、滅菌時間或F₀值。一個好的滅菌器和滅菌程序，既要使所有待滅菌產(chǎn)品達(dá)到一定的F₀值，以保障產(chǎn)品的SAL≤10^－6，同時又不能使部分產(chǎn)品受熱過度而造成產(chǎn)品中活性成分的降解，導(dǎo)致同一滅菌批次的產(chǎn)品出現(xiàn)質(zhì)量不均一。

　　熱穿透試驗的溫度探頭的個數(shù)和安裝位置可參考裝載熱分布設(shè)置，安裝位置的確定應(yīng)基于風(fēng)險評估的原則，包括熱分布試驗確定的和其他可能的高溫點和低溫點、滅菌器溫度探頭附近、產(chǎn)品溫度記錄探頭處等。除要求采用足夠數(shù)量的溫度探頭外，還應(yīng)將熱穿透溫度探頭置于藥液中最難或最遲達(dá)到滅菌溫度的點、或F₀值最低的點，即整個包裝中最難滅菌的位置。對于小容量注射液如果有數(shù)據(jù)支持或有證據(jù)表明將探頭放在產(chǎn)品包裝之外也能夠反映出產(chǎn)品的滅菌程度，風(fēng)險能夠充分得到控制，也可以考慮將探頭放在容器之外。

　　熱穿透試驗的步驟及要求與裝載熱分布試驗基本相同，每一裝載方式的熱穿透試驗也需要至少進(jìn)行三次。通過熱穿透試驗可以確定在設(shè)定的滅菌程序下，滅菌器內(nèi)各個位置的待滅菌產(chǎn)品是否能夠到達(dá)設(shè)定的滅菌溫度、滅菌時間或F₀值。再結(jié)合滅菌前微生物污染水平的檢測，可以確定滅菌器內(nèi)各個位置的待滅菌產(chǎn)品是否能夠達(dá)到預(yù)期的無菌保證水平。

　　對于F₀值最大點位置的樣品，由于其受熱情況最為強烈，因此應(yīng)評估該位置產(chǎn)品的穩(wěn)定性情況，以進(jìn)一步確認(rèn)滅菌對于產(chǎn)品的穩(wěn)定性沒有影響。

　　1.5 熱分布和熱穿透試驗數(shù)據(jù)的分析處理

　　在物理確認(rèn)試驗中，應(yīng)確認(rèn)關(guān)鍵和重要的運行參數(shù)并有相應(yīng)的文件和記錄。需要關(guān)注的主要參數(shù)可能包括：

　　- 保溫階段每個探頭所測得溫度的變化范圍

　　- 保溫階段不同探頭之間測得的溫度差值

　　- 保溫階段探頭測得的溫度與設(shè)定溫度之間的差值

　　- 升溫階段探頭測得達(dá)到設(shè)定溫度的最短及最長時間

　　- F₀的最大值及最小值

　　- 滅菌結(jié)束時的最低F₀值

　　- 保溫階段腔室的最低和最高溫度

　　- 熱穿透溫度探頭之間的最大溫差或F₀的變化范圍

　　- 最長平衡時間

　　- 正常運行的探頭數(shù)

　　以上參數(shù)的合格標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)結(jié)合滅菌條件、滅菌設(shè)備的特點以及產(chǎn)品的實際情況制定。通常情況下，熱分布試驗的保溫階段內(nèi)溫度波動應(yīng)在±1.0℃之內(nèi)，升、降溫過程的溫度波動可通過總體F₀值來反映。如果溫度或F₀值差別超過可接受范圍（需要根據(jù)設(shè)備、產(chǎn)品等實際情況，依據(jù)風(fēng)險評估擬定科學(xué)合理的接受范圍），提示滅菌器的性能不符合要求、裝載方式選擇不當(dāng)?shù)龋枰獙ふ以虿⑦M(jìn)行改進(jìn)，重新進(jìn)行驗證。另外對于熱敏感的藥物，還應(yīng)該控制滅菌器的升溫和降溫時間，以保證輸入的熱能控制在合理的范圍內(nèi)，不會對產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性造成影響。

　　2. 生物學(xué)確認(rèn)

　　濕熱滅菌工藝的微生物挑戰(zhàn)試驗是指將一定量已知D_T值的耐熱芽孢（生物指示劑）在設(shè)定的濕熱滅菌條件下進(jìn)行滅菌，以驗證設(shè)定的滅菌工藝是否確實能使產(chǎn)品達(dá)到預(yù)定的無菌保證水平。生物指示劑被殺滅的程度，是評價一個滅菌程序有效性的直觀指標(biāo)。

　　2.1 生物指示劑選用的一般原則

　　生物指示劑的選用參照《中國藥典》（2020年版）四部通則9207“滅菌用生物指示劑指導(dǎo)原則”^[11]。針對具體的滅菌工藝和具體的產(chǎn)品，還應(yīng)注意所用的生物指示劑的耐受性應(yīng)強于待滅菌產(chǎn)品中的污染菌。

　　濕熱滅菌工藝常用的生物指示劑有以下幾種，嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus，曾用名：嗜熱脂肪芽孢桿菌）、生孢梭菌、枯草芽孢桿菌等。對于采用過度殺滅法的滅菌程序，生物指示劑系統(tǒng)主要是嗜熱脂肪地芽孢桿菌的芽孢，或其他D_121°C值大于1分鐘的芽孢。殘存概率法由于其熱輸入量比較低，因此在驗證中使用的生物指示劑的耐受性可以小于嗜熱脂肪地芽孢桿菌。

　　2.2 生物指示劑的使用和放置

　　實際驗證過程中可以將生物指示劑接種到待滅菌產(chǎn)品中或直接使用市售的生物指示劑成品。由于生物指示劑在不同介質(zhì)或環(huán)境中的耐受性會有所不同，所以無論是將生物指示劑接種到待滅菌產(chǎn)品的方法，或直接使用市售的生物指示劑成品，均應(yīng)考慮待滅菌產(chǎn)品對細(xì)菌芽孢耐受性的影響，如果待滅菌產(chǎn)品會使芽孢的耐受性增加，應(yīng)采用直接接種到待滅菌產(chǎn)品的方法。如果生物指示劑與產(chǎn)品不相容，可以用與產(chǎn)品相似的溶液來代替產(chǎn)品。使用市售生物指示劑時，應(yīng)確保生物指示劑的D_T值和總芽孢數(shù)等主要質(zhì)量參數(shù)的準(zhǔn)確性。

　　生物指示劑的接種量（即初始芽孢數(shù)）需要根據(jù)生物指示劑在待滅菌樣品中的耐受性和滅菌工藝條件來確定，應(yīng)符合挑戰(zhàn)性試驗的要求。生物指示劑的接種量可用附件2的方法計算。生物指示劑的數(shù)量和放置位置應(yīng)綜合滅菌器的幾何形狀、空腔尺寸、產(chǎn)品的裝載方式以及熱分布確認(rèn)的結(jié)果等要素確定，且在滅菌設(shè)備的冷點處必需放置生物指示劑。裝有生物指示劑的容器應(yīng)緊鄰于裝有測溫探頭的容器，直接接種供試品宜放置在熱穿透試驗產(chǎn)品的緊鄰位置，滅菌器的其他部位應(yīng)裝載產(chǎn)品或者類似物，以盡可能的模仿實際生產(chǎn)時的狀況。

　　2.3 滅菌

　　生物指示劑挑戰(zhàn)試驗應(yīng)該按照產(chǎn)品設(shè)定的滅菌工藝進(jìn)行滅菌。每個產(chǎn)品的每一滅菌程序，至少需要連續(xù)進(jìn)行三次生物指示劑挑戰(zhàn)試驗。

　　2.4 檢查和培養(yǎng)

　　可以根據(jù)生物指示劑的生長特性以及驗證時的接種方式，采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行檢查和培養(yǎng)。完成滅菌后，盡快將挑戰(zhàn)指示劑放入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。需要注意不同的生物指示劑所需要的培養(yǎng)條件也各不相同，建議參照所用生物指示劑的特性和供應(yīng)商的說明書來選擇培養(yǎng)條件，同時應(yīng)放置陽性對照品和陰性對照品。

　　2.5 試驗結(jié)果的評價

　　根據(jù)生物指示劑的D_T值、接種量以及挑戰(zhàn)試驗驗證結(jié)果，結(jié)合產(chǎn)品滅菌前微生物的污染水平（耐受性及微生物污染數(shù)量）來評價產(chǎn)品在驗證的滅菌條件下實際達(dá)到的SAL值。如果驗證結(jié)果出現(xiàn)不合格，需要分析原因，采取相應(yīng)的改進(jìn)措施后重新進(jìn)行驗證工作。

　　3. 基于風(fēng)險評估的驗證方案設(shè)計

　　濕熱滅菌工藝驗證時，如存在不同滅菌器（一般指相同工作和設(shè)計原理的滅菌器）、處方組成、容器規(guī)格、裝量、裝載方式等情況，在不犧牲無菌保證水平的前提下，為減少驗證試驗數(shù)量，降低驗證成本，可綜合各方面因素考慮，在風(fēng)險評估的基礎(chǔ)上，通過充分的合理性論證，選用具有代表性的滅菌器、待滅菌產(chǎn)品和裝載方式等進(jìn)行滅菌工藝驗證，可不必對所有情況進(jìn)行驗證。

三、注射劑無菌生產(chǎn)工藝

　　注射劑應(yīng)首選終端滅菌工藝。如經(jīng)充分的研究（包括處方工藝研究、質(zhì)量控制研究等）證實產(chǎn)品無法耐受終端滅菌工藝，則可考慮能否通過除菌過濾工藝進(jìn)行過濾除菌，如果可以，可采用包含除菌過濾的無菌工藝；如果不可以，則可考慮采用無菌分裝的全無菌工藝。

　　（一）無菌生產(chǎn)工藝的研究

　　1. 除菌過濾工藝的研究

　　除菌過濾是指采用物理截留的方法去除液體中的微生物，以達(dá)到無菌藥品相關(guān)質(zhì)量要求的過程。采用除菌過濾工藝時，工藝研究和生產(chǎn)過程控制的重點是影響無菌保證水平的工藝步驟和工藝參數(shù)，主要包括物料（如原料藥、輔料、內(nèi)包裝材料等）的質(zhì)量控制、除菌過濾系統(tǒng)的設(shè)計及選擇、除菌過濾工藝參數(shù)的研究、除菌過濾生產(chǎn)過程的控制等。

　　通常，除菌級過濾器在工藝條件下每平方厘米有效過濾面積可以截留≥10⁷cfu（colony forming unit，集落/菌落形成單位）的缺陷短波單胞菌（Brevundimonas diminuta，曾用名：缺陷假單胞菌）。除菌過濾工藝通常選用 0.22μm（更小孔徑或相同過濾效力）的除菌級過濾器。

　　應(yīng)盡可能采取措施降低除菌過濾的風(fēng)險，例如：①宜安裝第二只已滅菌的除菌過濾器，最終的除菌過濾器應(yīng)當(dāng)盡可能接近灌裝點；②由于微生物通過除菌過濾器的概率隨著待過濾藥液中微生物數(shù)量的增加而增加，最終除菌過濾前，待過濾藥液的微生物負(fù)荷一般小于等于10cfu/100ml；③應(yīng)通過研究確定藥液配制后至過濾前的存放時間、藥液過濾操作的時間、過濾后至灌裝前放置的時間等工藝時限。

　　除菌過濾器的除菌過濾效能是評價除菌過濾工藝的重要參數(shù)，需要進(jìn)行相應(yīng)的研究和驗證。通常，影響除菌過濾器的除菌過濾效能的因素包括：①藥液的性質(zhì)，如藥液的黏度、表面張力、pH值、滲透壓等；②過濾步驟的工藝參數(shù)，如過濾的壓力、流速、時間、溫度等；③除菌過濾器與所過濾的藥液的相互作用，如除菌過濾器與藥液的相容性；④除菌過濾器預(yù)處理、過濾總量和使用周期等。除菌過濾器的過濾效能可因產(chǎn)品和操作條件不同而不同，濾器的選擇及工藝參數(shù)的研究應(yīng)考慮上述因素。

　　2. 無菌分裝工藝的研究

　　無菌分裝工藝是指滅菌/除菌工藝處理后的原料藥或者原料藥和輔料，用無菌操作的方法分裝到滅菌后的容器中再進(jìn)行密封的生產(chǎn)工藝。無菌分裝工藝的工藝研究和生產(chǎn)過程控制的重點同樣是影響無菌保證水平的工藝步驟，主要包括物料（原料藥、輔料、內(nèi)包裝材料等）的質(zhì)量控制、物料暴露于環(huán)境中可能再污染的操作步驟等。

　　關(guān)于物料的質(zhì)量控制，采用無菌分裝工藝的制劑所涉及的所有物料，都必須采用適當(dāng)?shù)臏缇?/span>/除菌工藝處理后方可使用。各物料的滅菌/除菌工藝，都應(yīng)經(jīng)過驗證、進(jìn)行監(jiān)測，并受到良好的控制。同時需要對各物料的無菌性、細(xì)菌內(nèi)毒素水平等進(jìn)行嚴(yán)格控制，通過研究確定相應(yīng)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

　　原料藥或者原料藥和輔料的分裝步驟是影響產(chǎn)品質(zhì)量和無菌保證水平的關(guān)鍵生產(chǎn)步驟，應(yīng)結(jié)合生產(chǎn)設(shè)備和產(chǎn)品特點進(jìn)行工藝參數(shù)（如分裝速度和分裝時間等）的研究，并確定相應(yīng)的工藝控制標(biāo)準(zhǔn)。

　　（二）無菌生產(chǎn)工藝的驗證

　　無菌生產(chǎn)工藝驗證主要包括除菌過濾工藝驗證及無菌工藝模擬試驗。采用除菌過濾工藝的產(chǎn)品應(yīng)進(jìn)行除菌過濾工藝驗證及無菌工藝模擬試驗，采用無菌分裝工藝的產(chǎn)品應(yīng)進(jìn)行無菌工藝模擬試驗。

　　1. 除菌過濾工藝驗證

　　除菌過濾工藝驗證一般包括細(xì)菌截留試驗、化學(xué)兼容性試驗、可提取物或浸出物試驗、安全性評估和吸附評估等內(nèi)容。應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品特點及實際過濾工藝中的最差條件，對相關(guān)驗證試驗進(jìn)行合理設(shè)計，具體驗證操作（如細(xì)菌截留試驗中挑戰(zhàn)用微生物的選擇、濾膜的要求，可提取物和浸出物試驗中的風(fēng)險評估、提取方式、檢測方法及安全性評估，化學(xué)兼容性試驗中應(yīng)重點考察的指標(biāo)，吸附試驗的試驗條件等）可參照《除菌過濾技術(shù)及應(yīng)用指南》^[12]及《化學(xué)藥品注射劑生產(chǎn)所用的塑料組件系統(tǒng)相容性研究技術(shù)指南》^[13]相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行。其中，結(jié)合產(chǎn)品特點，還應(yīng)關(guān)注的內(nèi)容如下：

　　1.1 細(xì)菌截留試驗中挑戰(zhàn)溶液的選擇

　　藥品和/或工藝條件本身可能會影響挑戰(zhàn)微生物的存活力，因此在進(jìn)行細(xì)菌截留試驗之前，需要確認(rèn)挑戰(zhàn)微生物于工藝條件下在藥品中的存活情況（生存性實驗/活度實驗），以確定合理的細(xì)菌挑戰(zhàn)方法。對于非殺菌性/非抑菌性的藥液，直接在藥液中接種測試微生物是測試除菌級過濾器（濾膜）細(xì)菌截留能力的首選方法；對于抑菌的/殺菌的藥液，可采用修改工藝（如調(diào)整溫度）、修改測試液配方（調(diào)整pH值、去除殺菌成分或使用產(chǎn)品的替代溶液）等方法對過濾器（濾膜）進(jìn)行預(yù)處理后再進(jìn)行細(xì)菌挑戰(zhàn)試驗。如果使用替代溶液進(jìn)行試驗，需要提供合理的數(shù)據(jù)和解釋。對于同一族產(chǎn)品，即具有相同組分而不同濃度的產(chǎn)品，可以用挑戰(zhàn)極限濃度的方法進(jìn)行驗證，替代性地接受中間的濃度。

　　1.2 細(xì)菌截留試驗條件的合理性

　　過濾溫度、過濾時間、過濾批量和壓差或流速等會影響細(xì)菌截留試驗的結(jié)果。建議對實際生產(chǎn)的過濾工藝進(jìn)行一次徹底評估，包括溶劑性質(zhì)（例如水性的、酸、堿、有機的）、過濾時間、工藝壓差、工藝流速、工藝溫度、過濾批量和過濾系統(tǒng)設(shè)計規(guī)范，以便合理設(shè)計微生物截留試驗條件。如果細(xì)菌截留驗證研究中，在過濾器的下游檢測到測試用微生物，則應(yīng)進(jìn)行調(diào)查。如果調(diào)查確認(rèn)測試用微生物能穿透完整性檢測達(dá)標(biāo)的過濾器，那么就應(yīng)重新考慮此種過濾器在這些工作條件下的適用性。

　　1.3 關(guān)于除菌過濾系統(tǒng)的完整性測試

　　完整性測試貫穿于細(xì)菌截留試驗以及化學(xué)兼容性試驗，除此之外，在藥品連續(xù)三批生產(chǎn)工藝驗證及常規(guī)生產(chǎn)過程中也涉及完整性測試。應(yīng)明確過濾器使用后完整性測試的潤濕介質(zhì)（包括水、醇類溶液等標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)或藥液），如果采用的潤濕介質(zhì)為藥液，則應(yīng)進(jìn)行產(chǎn)品相關(guān)完整性標(biāo)準(zhǔn)的驗證以支持該標(biāo)準(zhǔn)的確定。對于冗余過濾，使用后應(yīng)先對主過濾器進(jìn)行完整性測試，如果主過濾器完整性測試通過，則冗余過濾器不需要進(jìn)行完整性測試；如果主過濾器完整性測試失敗，則需要對冗余過濾器進(jìn)行完整性測試。對于經(jīng)過驗證需要一系列（兩個或以上）的除菌級過濾器的除菌單元，在使用后必須全部通過完整性測試。

　　1.4 關(guān)于濾器重復(fù)使用時的驗證考慮

　　過濾器的重復(fù)使用對于制藥過程來說是不被推薦的，如在實際工作中存在重復(fù)使用的情況，應(yīng)進(jìn)行充分的風(fēng)險評估，包括細(xì)菌的穿透、過濾器完整性缺陷、可提取物的變化、清洗方法對產(chǎn)品內(nèi)各組分清洗的適用性、產(chǎn)品存在的殘留（或組分經(jīng)滅菌后的衍生物）對下一批次產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險的影響、過濾器過早堵塞、過濾器組件老化引起的性能改變等，并提供充分的驗證和數(shù)據(jù)支持。

　　1.5 關(guān)于采用減菌過濾工藝時應(yīng)進(jìn)行的驗證

　　減菌過濾通常設(shè)計在終端滅菌工藝生產(chǎn)的無菌制劑的灌裝前端，或非最終滅菌工藝生產(chǎn)的無菌制劑的除菌過濾工序前端。通常采用0.45μm或0.22μm（及以下）孔徑的過濾器。針對減菌過濾應(yīng)進(jìn)行的驗證包括化學(xué)兼容性、可提取物/浸出物及吸附試驗等。

　　2. 無菌工藝模擬試驗

　　無菌工藝模擬試驗是指采用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基或其他介質(zhì)，模擬制劑生產(chǎn)中無菌操作的全過程，評價該工藝無菌保障水平的一系列活動。應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品特點及實際工藝中的最差條件，對相關(guān)驗證試驗進(jìn)行合理設(shè)計，具體驗證操作，包括模擬介質(zhì)的選擇與評價（培養(yǎng)基、其他介質(zhì)）、灌裝數(shù)量及容器的裝量、最差條件的選擇、培養(yǎng)方式、結(jié)果評價等，可參照《無菌工藝模擬試驗指南（無菌制劑）》^[12]相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行。同時，應(yīng)重點關(guān)注以下內(nèi)容：

　　2.1 最差條件及干預(yù)操作的代表性

　　應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品實際生產(chǎn)工藝，評估模擬試驗設(shè)計的最差條件及干預(yù)操作是否能夠涵蓋實際生產(chǎn)過程中可能產(chǎn)生的情況。

　　最差條件并不是指人為創(chuàng)造的超出允許范圍的生產(chǎn)狀況和環(huán)境。為了確認(rèn)無菌工藝風(fēng)險控制的有效性，應(yīng)通過風(fēng)險評估并結(jié)合無菌生產(chǎn)工藝、設(shè)備裝備水平、人員數(shù)量和干預(yù)等因素來設(shè)計模擬試驗最差條件。包括但不限于以下方面：1）人員：應(yīng)充分考慮人員及其活動對無菌生產(chǎn)工藝帶來的風(fēng)險。如模擬生產(chǎn)過程的最多人數(shù)，當(dāng)操作人員數(shù)量減少可能導(dǎo)致其他方面污染風(fēng)險增加時，則此類條件也視為最差條件之一。參與人員應(yīng)包括日常參與到無菌生產(chǎn)的全部人員，如生產(chǎn)操作、取樣、環(huán)境監(jiān)測和設(shè)備設(shè)施維護(hù)人員，同時應(yīng)考慮以上人員交叉作業(yè)、班次輪換、更衣、夜班疲勞狀態(tài)等因素。2）時限：在條件允許的情況下，適當(dāng)考慮模擬實際生產(chǎn)操作過程中房間、設(shè)備、物料消毒或滅菌后放置的最長時間及最長的工藝保留時限等，如設(shè)備設(shè)施、分裝容器、無菌器具滅菌后最長的放置時間等。3）灌裝速度/分裝速度：模擬試驗應(yīng)涵蓋產(chǎn)品實際灌裝速度范圍，基于無菌風(fēng)險的角度分析評價灌裝速度對工藝過程及其他方面的影響程度。例如采用最慢的灌裝速度、最大的容器用以模擬最長暴露時間；或采用最快的灌裝速度、最小的容器時，用以模擬最大操作強度/難度。4）環(huán)境：無菌工藝模擬試驗期間環(huán)境的消毒處理應(yīng)依據(jù)正常生產(chǎn)期間的消毒方法進(jìn)行，避免過度消毒及消毒劑的過度使用。

　　干預(yù)是指由操作人員按照相關(guān)規(guī)定參與無菌工藝生產(chǎn)的所有操作活動。干預(yù)可分為固有干預(yù)和糾正性干預(yù)。固有干預(yù)是指常規(guī)和有計劃的無菌操作，如裝載膠塞、環(huán)境監(jiān)控、設(shè)備安裝、取樣頻次等；糾正性干預(yù)是指對無菌生產(chǎn)過程的糾正或調(diào)整，如生產(chǎn)過程中更換部件、設(shè)備故障排除等。

　　2.2 不同形式注射劑無菌工藝模擬試驗

　　2.2.1 注射液

　　注射液通常采用培養(yǎng)基溶液進(jìn)行常規(guī)的無菌工藝模擬試驗。

　　2.2.2 注射用凍干粉末

　　注射用凍干粉末的無菌工藝模擬試驗還包括凍干過程的進(jìn)箱、凍干、出箱操作（冷凍可能會抑制微生物生長，通常不模擬冷凍過程），通常情況下可采用縮短維持時間模式，即培養(yǎng)基灌裝到容器中，半壓塞后將容器轉(zhuǎn)移至凍干機內(nèi)部分抽真空，維持時間短于實際凍干周期，然后箱體破空（可依據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)計破空次數(shù)）后進(jìn)行壓塞。

　　2.2.3 注射用無菌粉末

　　注射用無菌粉末其分裝所用的生產(chǎn)線與常規(guī)液體灌裝線不同，進(jìn)行無菌工藝模擬試驗時需要將培養(yǎng)基及模擬介質(zhì)均灌裝入容器中，模擬方法通常包括：使用無菌粉末分裝設(shè)備將液體培養(yǎng)基和模擬介質(zhì)進(jìn)行一步灌裝；加裝特殊設(shè)備灌裝液體培養(yǎng)基；先在線灌裝無菌液體培養(yǎng)基到容器中，然后再在生產(chǎn)線上進(jìn)行無菌粉末的分裝模擬；先在生產(chǎn)線上進(jìn)行無菌粉末的分裝，然后再灌裝無菌液體培養(yǎng)基到容器中；或其他方式。應(yīng)根據(jù)具體情況設(shè)計培養(yǎng)基灌裝工藝，并充分說明設(shè)計的合理性。

四、附件

附件1：注射劑滅菌工藝選擇的決策樹

附件 2：生物指示劑的接種量（即初始芽孢數(shù)）的計算方法

根據(jù)公式：lgN₀= F_{（T，z）} / D_T+lgN_T

　　公式中，F_（T，z）——在規(guī)定的溫度系數(shù)（z 值）下，滅菌工藝期望獲得的溫度 T/℃下的等效滅菌時間，min；

D_T——生物指示劑在溫度 T/℃下的耐熱參數(shù)，min；

N₀——滅菌前生物指示劑的初始芽孢數(shù)；

N_T——滅菌后生物指示劑的存活芽孢數(shù)；

一般在滅菌驗證時，要求滅菌后所有生物指示劑為陰性結(jié)果（即全部殺滅），則N_T實際能夠達(dá)到10^-1～10^-2，甚至更低。但是，為了增加滅菌保障的安全邊際，一般取N_T=1，即lgN_T =0。以上公式中，當(dāng)生物指示劑確定后，其D_T可確定，滅菌工藝確定后，所期望的滅菌值F_{（T，z）}可確定，lgN_T取0，則可計算 N₀。特殊情況下，若選取N_T＜1計算N₀，應(yīng)提供合理性說明。

    五、參考文獻(xiàn)

[1] 《中國獸藥典》（2020年版）中國農(nóng)業(yè)出版社，2020.

[2] 獸藥生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2020年修訂）（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部令 2020年第3號）.

[3] 《獸藥生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2020年修訂）》配套文件（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第292號）.

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[12] 國家藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于發(fā)布除菌過濾技術(shù)及應(yīng)用指南等3個指南的通告（2018年第85號）.

[13] 國家藥監(jiān)局藥審中心.化學(xué)藥品注射劑生產(chǎn)所用的塑料組件系統(tǒng)相容性研究技術(shù)指南（試行）（2020年第33號）.

來源：獸藥評審中心

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獸用化學(xué)藥品注射劑滅菌和無菌工藝研究及驗證指導(dǎo)原則.docx